Nanoparticules à base d'or ou de quantum dots pour localiser spécifiquement par microscopie la présence de biopolymères dans les systèmes biologiques naturels ou formulés

Les biopolymères sont des polymères largement présents dans le monde végétal ou animal et présentent un intérêt indéniable dans le domaine alimentaire (mousse, émulsions) ou non alimentaire (biomatériaux). Leur étude nécessite des outils d'investigation performants tant pour les caractériser de façon précise que pour les suivre dans leur environnement.
Cependant la détection directe de ces biopolymères est souvent impossible, notamment si on veut utiliser la  microscopie. C'est pourquoi ils sont marqués à l'aide de sondes spécifiquement développées à cet effet.

Parmi elles, les  quantum dots sont définis comme des cristallites à base de composés semi-conducteurs doués d’une fluorescence intense et persistante. Ils sont particulièrement appropriés au suivi dynamique des protéines par microscopie de fluorescence. Une autre façon de suivre les protéines, dans les tissus vivants, est de les faire réagir avec un antigène ou un anticorps sur lequel est greffé une nanoparticule d’or facilement détectable en microscopie électronique.
La stabilité des quantum dots et des nanoparticules d’or contre l’agrégation est un paramètre essentiel en vue de leur manipulation et de leur utilisation pour l’imagerie des systèmes biologiques. La plupart des agents stabilisant actuellement utilisés sont des molécules de synthèse dont la production est potentiellement toxique pour l’environnement. C'est pourquoi nous avons utilisé des acides gras issus des produits de l’agriculture.

Des nanosomes d'origine végétale pour la synthèse contrôlée des nanoparticules

Lors de travaux antérieurs, nous avions montré que des acides gras hydroxylés en position terminale forment en solution aqueuse des micelles [1].Cependant, du fait du groupement hydroxyle, ces micelles ont un caractère particulier puisqu’elle possèdent un cœur hydrophile (figure 1). Nous avons nommé ces micelles ‘nanosomes’ de part leur taille et par analogie avec les liposomes. Ces nanosomes représentent des nano-containers susceptibles de piéger et protéger des biomolécules et nous avons pensé à les utiliser comme agent de stabilisation dans le cas des quantum dots et des nanoparticules d’or.

Figure 1 : acide junipérique (WOH), dérivé mercapto (WSH) et illustration des nanosomes en solution aqueuse.

Préparer des quantum dots stables dans l'eau en variant la taille des nanosomes

Nous nous sommes principalement intéressés à faire varier la longueur de la chaîne aliphatique de l’acide gras mercapto-hydroxylé utilisé ainsi que la nature du contre-ion utilisé pour former des nanosomes. L’optique était de moduler la stabilité des quantum dots en fonction de l’interface du nanosome. Nous avons ainsi démontré la possibilité de construire des systèmes micellaires formés par l’association entre des acides gras de différentes longueurs 3, 11 ou 16 carbones et des contre-ions dont l’encombrement stérique varie (tetrabutyl, tetrapropyl, tetraethyl, tetramethyl ammonium).

Les dispersions colloïdales de CdS et de CdSe émettent dans le visible et sont fortement fluorescentes sous irradiation UV (figure 2a). Les caractérisations par microscopie électronique et à force atomique (AFM), UV-visible et RX réalisées sur les quantum dots purifiés démontrent que la méthode employée aboutit à la formation de particules hybrides, dont la taille varie de 1 à 5 nm selon le colloïde utilisé, et structurées par la présence d’un cœur cristallin et d’une couronne organique.

Des quantum dots à base de séléniure de cadmium (CdSe) et de sulfure de cadmium (CdS) (figure 2b et 2c) ont ainsi été synthétisés, purifiés et isolés sous forme de poudre. Nous avons observé que la nature du milieu micellaire conditionne la stabilité à long terme de ces quantum dots colloïdaux. Aucune agrégation des nanoparticules de CdS et de CdSe n’est perceptible après plusieurs mois lorsqu’elles possèdent les chaînes alkyles les plus longues alors qu’un déplacement de l’émission de fluorescence vers le rouge, signe d’agrégation, est perceptible pour les chaînes les plus courtes.

Figure 2 : (a) Photographies de solutions de quantum dots de séléniure de cadmium stabilisés (par trois types de nanosomes) émettant dans le visible (a1, a2, a3) et en fluorescence (a1’, a’2, a’3)  ; (b) Quantum dots à base de sulfure de cadmium observées par microscopie à force atomique (AFM) et (c) observés par microscope électronique à transmission.

Des nanosomes de compositions variées pour préparer des nanoparticules d'or

Nous avons développé plusieurs méthodes de préparation de nanoparticules d’or en utilisant de l’acide junipérique (WOH) mais également son dérivé mercapto (WSH) (fig. 1). En mélangeant ces deux molécules en proportions différentes, nous avons pu synthétiser des nanoparticules d’or de diamètre variable de 1 à 10 nm (fig. 3). Plus la proportion de WSH est forte, plus la nanoparticule d’or est petite, cette molécule agissant alors comme un agent ‘bloquant’ la croissance des nanoparticules d’or lors de leur synthèse.

Une deuxième méthode consistait à utiliser uniquement l’acide junipérique sans réducteur. En chauffant les solutions, des nanoparticules d’or de 5 nm se forment au bout de quelques minutes. Dans tous les cas, elles sont stabilisées par une enveloppe d’acide gras qui les protège de la précipitation avec une structure analogue à celle des quantum dots.
Nous avons montré également qu’il est possible de transférer ces nanoparticules d’or dans des solvants organiques ce qui peut avoir un intérêt pour certaines applications. Dans ce sens, nous avons commencé des essais de formulation d’émulsions.

Figure 3 : nanoparticules d’or observées en microscopie à transmission électronique et représentation schématique d’une nanoparticule d’or incorporée dans un nanosome.

De futures applications en imagerie

Nous projetons maintenant d'utiliser la capacité de contrôler la synthèse de nanoparticules, par variation de la taille et/ou de la composition de nanosomes d'origine végétale, pour réaliser des applications en imagerie. Pour cela, les quantums dots et les nanoparticules d'or seront couplés à des biopolymères ou à des anticorps pour suivre leur évolution dans des systèmes naturels ou modèles d'intérêt agroalimentairesParallèlement, le protocole ainsi établi sera appliqué à la synthèse d’autres quantums dots dont les caractéristiques de fluorescence complèteront celles des quantum dots déjà réalisées.

Un partenariat entre chimistes, physicochimistes et physiciens :

Travaux conduits à l'Unité Biopolymères, Interactions, Assemblages de l'INRA de Nantes, en partenariat avec :
Centre de Recherche Paul Pascal (CNRS) Pessac : caractérisation des assemblages par diffusion de neutrons.
Laboratoire Léon Brillouin, CEA Saclay : expérimentations.
Laboratoire de Catalyse en Chimie Organique de l’Université de Poitiers : application en synthèse organique.
L’Institut des Matériaux de Nantes : caractérisation physico-chimique des quantum dots
UMR CNRS 6230-’Université de Nantes : pour la modification chimique des quantum dots.